Радиоиммунный анализ — РИА – или изотопный иммунологический анализ — это один из современных количественных методов исследования БАЖ с определением в них количеств БАВ. К таким веществам относятся гормоны и некоторые ферменты. Метод отличается исключительной точностью и высокой чувствительностью. Об этом говорят нано — и пикограммовые количества исследуемого вещества.
Содержание
Где применяется подобная технология
Особенно применяет РИА микробиология для выявления положительной реакции на антитела, причем, исследовать можно любой заразный биоматериал, если он предварительно обезврежен. К такому относятся: кровь, суспензии органов животных, объекты внешней среды, материал после обогащения на питательных средах и т. д. Реакция считается положительной, если реагенты взаимодействуют с антителами в крови пациента. Анализировать можно и любые химические вещества, против которого можно получить специфические антитела. Метод количественно определяет любой антиген.
При помощи РИА можно исследовать большое количество проб в минимальном объеме и быстро (за несколько часов), производить количественный учет результатов, полностью или частично автоматизировать их.
Суть реакций в том, что искомые стабильные и аналогичные им меченные радионуклидом вещества связываются со специфическими связывающими системами, и затем считываются на специальных счётчиках — радиоспектрометрах.
Данная метода была разработана в 50-х годах прошлого века Соломоном Берсоном и Розалин Сасмен Ялоу. Они изучали тогда клиренс инсулина. В 1977г. Р. Ялоу получила за это Нобелевскую премию.
Методика проведения анализа
Все исследования выполняют in vitro, что означает «в пробирке». Для РИА созданы и выпущены стандартные наборы реагентов, которые предназначены для определения концентрации только одного определенного вещества.
Для каждого вида исследуемого материала и выявляемого БАВ или антитела исследуемого микроорганизма применяют специфические стандартизированные наборы реагентов. В силу такой стандартизации погрешностей в результатах практически не бывает.
Проведение анализа
Забор крови напоминает анализ крови на биохимию — утром натощак проводят забор венозной крови. Затем в лаборатории отделяют сыворотку, необходимую для РИА.
Работа состоит из нескольких этапов: биоматериал смешивается с нужным реагентом; меченый антиген добавляется в определенном количестве, чтобы можно было установить часть вещества, которая связалась с антителами и другую часть, которая останется несвязанной.
- Эту смесь инкубируют в течение нескольких часов в термостате при определенной температуре.
- Свободное и связанное радиоактивное вещество разделяются после этого.
- И только потом проводят само исследование — проводится радиометрия проб при помощи счетчиков.
- Результаты подсчитываются и строится специальная кривая.
Вариантов исследования существует несколько.
Описанная вариация применяется для жидкофазного РИА, когда все реагенты жидкие.
Есть и твердофазная реакция. Тогда антитела помещают в нерастворимый в жидкости носитель, например полистирол.
Еще разновидность — иммунорадиометрическое исследование. При нем изотопами метят антитела, а не антигены. Антитела и антигены чаще всего помечают изотопом йода 125I или 131, с периодом полураспада в 60 дней и высокой радиоактивностью. Эти изотопы – гамма-излучающие. Выявляется комплекс АГ-АТ, где 1 из составляющих метится изотопом. Реакцию учитывают по любому изменению радиоактивности с помощью b- или g- счетчиков.
Хотя радиоиммунный анализ чувствителен и точен, он постепенно сегодня начинает вытесняться более безопасными методами – ИФА, например, где нет опасности работы с радиоактивными изотопами. Но при выявлении ЛС, гормонов – стероидных или пептидных в роли антигенов, РИА используют широко.
АТ могут сорбировать и на твердую фазу (например, полистироловые шарики). В комплекс добавляют исследуемый материал с его концентрацией изучаемого АГ. Меченый АГ при этом вытесняется в прямой пропорции.
Этот вытесненный АГ с его радиоактивностью и измеряется. По нему определяют и концентрацию неизвестного АГ.
Клеточные методы оценки иммунитета
К ним относятся 2 метода – РБТЛ и РПМЛ. Реакция бласттрансформации лимфоцитов (РБТЛ) – основана на том, что при контакте с чужеродным антигеном лимфоцит трансформируется из малых форм в бласты, которые делятся и дифференцируются.
Один бласт может давать клон из 16-64 клеток. Морфология при этом меняется: идет синтез белков, меняется обмен фосфолипидов, мембрана становится повышено проницаемой для ионов и пр. Вот эту функциональную активность синтеза ДНК и измеряет этот метод.
Реакция подавления миграции лейкоцитов (РПМЛ) – выявляет сенсибилизированные к предполагаемому антигену лимфоциты.
Применяется для выявления аллергии на ЛС. Эти лимфоциты выделяют медиаторы цитокины, которые подавляют подвижность других лейкоцитов.
Кожные и другие провокационные пробы
Для определения аллергии к антигенам-аллергенам вводят его перорально, ингаляционно, скарификатором через кожу и через 30 минут проверяют немедленные аллергические реакции (ПЧНТ), а через 1-2 суток – замедленные (ПЧЗТ).
Немедленные возникают чаще на пищу, пыльцу, лекарства – в виде покраснения и припухлости. Замедленные – на бактерии.
Пробу Манту ставят для определения сенсибилизации к МБТ. Оценивается вакцинация и инфицированность. Туберкулин РРD вводят внутрикожно и при + реакции через 1-2 суток появляется покраснение. Это указывает на сенсибилизацию организма. Если краснота более 1 см или ее нет вовсе – это говорит о ТБ.
Кожные пробы используются для выявления иммунодефицитов и резистентности к определенной инфекции, потому что человек в течение жизни сталкивается с антигенами распространенных условно-патогенных бактерий и к ним сенсибилизирован.
Пробы ставят с аллергенами стафило- и стрептококков, кишечной палочки и др. Положительная реакция должна быть хотя бы на один. Если ее нет – это указывает на иммунодефицит.
Когда применяют РИА?
Поле деятельности для использования РИА довольно широкое. Часто именно этот метод становится «истиной в последней инстанции», потому что для него нет затруднений определения гормонов даже в млн. частях миллионной части грамма. При его помощи можно определять любые практически гормоны:
- Поджелудочной железы, ЖКТ, ЩЖ, гипофиза; для измерения не гормонов: ферментов, иммуноглобулинов, лекарственных веществ, опухолевых антигенов, белков сыворотки крови и др.
- В кардиологии при тяжелых состояниях больного;
- При опухолях – им выявляют маркеры опухоли, и контролируют качество лечения.
- В эндокринологии – методом можно определять колебания и содержание гормонов в крови и моче.
- Гинекология – выявляют причины бесплодия у мужчин и женщин; прогнозируют возможные нарушения плода еще в эмбриогенезе, когда они еще не видимы для других методов; определяют содержание гормонов в динамике в разные фазы МЦ.
- Инфекционистам РИА позволяет уточнять диагноз при ОКИ, тифах и пр.
Доступность метода
Такой метод всегда востребован в любой клинике, но камнем преткновения становится дороговизна его. Высокоточная аппаратура радиоиммунологического метода дорого стоит. Имеются в виду его гамма- и бета-счетчики, компьютеры и камеры глубокого охлаждения.
Также дорого стоят расходные материалы и реактивы. Из-за короткого времени распада радиоактивных компонентов срок их использования короток, следовательно, его надо быстро обновлять.
Повсеместное внедрение РИА затруднено еще и потому, что трудно получать стандартные меченые высоко специфические сыворотки и антигены, реактивы с высокой степенью чистоты стандартов. Нужно соблюдать правила безопасности при работе с радиоактивными изотопами.
Себестоимость от этого всего еще больше повышается.Несмотря на все преимущества РИА, он исподволь заменяется более современными и безопасными в работе методами.
Например, для количественного определения Ig РИА сегодня не используют. Его заменили модификации ИФА, которые имеют так же высокую чувствительность, но нет работы с источниками радиации.
Так есть ли перспективы у РИА
Перспектива есть и касается она широкой области определения вирусов. Проблема эта касается стран «третьего мира», где самый высокий уровень смертности среди населения.
Здесь вирусы могут распространяться молниеносно. Поэтому экспресс-методы, которым является РИА, значительно помогли бы снизить эту смертность и улучшить уровень жизни этих стран. Поэтому еще рано задвигать РИА в дальний ящик, пока он просто переходит на другой качественный уровень своего развития.
